Αρχές Δειγματοληψίας Βιοχημικών Παραμέτρων (EN)

Η μέτρηση διαφόρων βιοχημικών παραμέτρων του αίματος αποτελεί προσπάθεια απεικόνισης των μεταβολικών δρόμων που διέπουν, τη συγκεκριμένη χρονική στιγμή, έναν οργανισμό.

Δανειζόμενοι την εξίσωση περιγραφής των ανοικτών θερμοδυναμικών συστημάτων, θα προσεγγιστούν οι εξωγενείς εκείνοι παράγοντες που αλυσιδωτά και μερικώς αντιστρεπτά παρεμβάλλονται ανάμεσα στην αιτία συλλογής του δείγματος και την εξαγωγή αξιόπιστου αποτελέσματος.

Ο ΤΡΟΠΟΣ ΣΥΛΛΟΓΗΣ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ

Αλλαγή συνθηκών πίεσης, θερμοκρασίας και ροής ενέργειας σε ζωντανό ιστό

Αυτό που θα πρέπει να τονιστεί είναι ότι το αίμα αποτελεί έναν ιστό ο οποίος υφίσταται διάφορες καταπονήσεις έως την τελική του χρησιμοποίηση για τον υπολογισμό των βιοχημικών παραμέτρων. Η μεταφορά του λοιπόν σε διαφορετικές συνθήκες πίεσης, θερμοκρασίας και ανταλλαγών μορφών ενέργειας οφείλει να γίνεται με τον πιο ήπιο τρόπο. Σημαντικότατο στάδιο για την ποιότητα του εξαγομένου αποτελέσματος είναι η συλλογή του δείγματος.

Καταρχήν η άσκηση πίεσης για την διάταση της φλέβας δεν πρέπει να είναι έντονη και για μεγάλο χρονικό διάστημα διότι H₂O και μικρομοριακές ουσίες, όχι όμως πρωτεΐνες και κύτταρα, θα περάσουν μέσω του ενδοθηλίου στο εξωκυττάριο υγρό. Έτσι προκαλείται αύξηση στη συγκέντρωση των πρωτεϊνών και εκείνων των στοιχείων όπως το ασβέστιο που είναι ολικώς ή εν μέρει συνδεδεμένα με αυτές. Επίσης το έμβολο της σύριγγας ακολουθεί τη ροή του αίματος και δεν θα πρέπει να είναι αυτό που τη δημιουργεί.

Τέλος το δείγμα μεταγγίζεται στον ανάλογο υποδοχέα χωρίς προηγούμενη αφαίρεση της βελόνας, η οποία μάλιστα σε επαφή με τα πλάγια τοιχώματα και με ελάχιστη πίεση επιτρέπει στο αίμα να κατεβαίνει αργά. Τα παραπάνω αποτελούν σημαντικά βήματα αποφυγής αιμόλυσης.

ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΣΗ ΠΛΑΣΜΑΤΟΣ – ΟΡΟΥ

• Άμεση Ανάλυση

• Εφαρμοζόμενη μεθοδολογία

• Επίδραση αντιπηκτικής ουσίας

Θεωρητικά η μόνη διαφορά ανάμεσα στο πλάσμα και στον ορό θα έπρεπε να είναι η απουσία του ινωδογόνου από τον δεύτερο. Στην πράξη δεν πρέπει να λησμονούμε ότι το πλάσμα του αίματος περιέχει και την αντιπηκτική ουσία. Κατά κύριο λόγο η επιλογή ενός εξ αυτών εξαρτάται από τους εξής παράγοντες:

1. Όταν είναι απαραίτητο να διαχωριστούν άμεσα τα έμμορφα συστατικά του αίματος, τότε προτείνεται το πλάσμα. Η φυγοκέντριση βέβαια γίνεται τα επόμενα λεπτά από την αιμοληψία αλλιώς αίρεται ο λόγος χρησιμοποίησής του.

2. Οι περισσότερες τεχνικές προσδιορισμού που έχουν αναπτυχθεί για τη μέτρηση βιοχημικών παραμέτρων στηρίζονται στην πορεία in vitro των ανάλογων κάθε φορά χημικών αντιδράσεων. Πολλά για παράδειγμα ένζυμα απαιτούν ιόντα μετάλλων για την εκδήλωση της μέγιστης ενζυμικής τους δραστηριότητας. Αντιπηκτικές ουσίες όπως το EDTA, τα οξαλικά ή το κιτρικό νάτριο τα οποία δρουν δεσμεύοντας κυρίως ιόντα ασβεστίου και μαγνησίου πρέπει να αποκλείονται. Το ίδιο ισχύει και για τον ποσοτικό προσδιορισμό παραμέτρων όπως ασβέστιο, μαγνήσιο, κάλιο, νάτριο και αμμώνιο που συμμετέχουν είτε στο μηχανισμό δράσης των διαφόρων αντιπηκτικών είτε ως συστατικά αυτών.

ΜΕΤΑΒΟΛΕΣ ΣΕ ΔΕΙΓΜΑ ΟΛΙΚΟΥ ΑΙΜΑΤΟΣ ΚΑΤΑ ΤΗ ΣΥΝΤΗΡΗΣΗ ΤΟΥ

Α. Απώλεια διοξειδίου του άνθρακα

HB ⇒ H⁺ + B

H⁺ + HCO₃⇔ H₂CO₃ ⇒ H₂O + CO₂

Η συγκέντρωση του CO₂ στο πλάσμα είναι μεγαλύτερη από αυτή της ατμόσφαιρας με αποτέλεσμα τη διάχυσή του από το πλάσμα στην ατμόσφαιρα καθώς και από τα κύτταρα στο πλάσμα. Κατά συνέπεια το αίμα γίνεται πιο αλκαλικό. Η αλλαγή στο pH περιορίζεται με τη μετατροπή διττανθρακικών ιόντων σε CO₂ και ύδωρ με τη σύγχρονη χρησιμοποίηση ιόντων Η⁺. Η διεργασία αυτή λαμβάνει χώρα κυρίως εντός των ερυθρών αιμοσφαιρίων όπου η συγκέντρωση ρυθμιστικών διαλυμάτων και δη της αιμοσφαιρίνης είναι υψηλότερη και η ανθρακική ανυδράση διαθέσιμη. Η μείωση των ενδοκυτταρικών διττανθρακικών αντισταθμίζεται με διάχυση από το πλάσμα, ενώ συγχρόνως ιόντα Cl περνούν στην αντίθετη κατεύθυνση για τη διατήρηση της ηλεκτρικής ουδετερότητας.

Β. Σχηματισμός αμμωνίας από αζωτούχες ενώσεις,

Σχηματισμός αμμωνίας από αζωτούχες ενώσεις με κυριότερη την ουρία δύναται να συμβεί σε αίμα το οποίο επιμολύνθηκε με βακτήρια. Η υδρολυτική αυτή μετατροπή καταλύεται από τη βακτηριακή ουρεάση. Αναφορικά με την αμμωνία πρέπει να έχουμε υπόψη ότι πρόκειται για μια έντονα πτητική ουσία και συγχρόνως αντιδρά με το ατμοσφαιρικό οξυγόνο σχηματίζοντας οξείδια αζώτου, νιτρώδη ή νιτρικά άλατα. Προτείνεται λοιπόν η λήψη αίματος υπό κενό και ο δυνατόν ταχύτερος προσδιορισμός της.

Γ. Μεταβολές στη συγκέντρωση του ανόργανου φωσφόρου.

• Κυριότερο ενδοκυτταρικό ανιόν: Pi ⇒ ΗΡΟ₄², Η₂ΡΟ₄

• Οργανικές μορφές (π.χ. Φωσφολιπίδια, νουκλεοτίδια, ΑΤΡ, φωσφοπρωτεΐνες)

• Σχηματισμός Pi από φωσφωρικούς εστέρες

• Επίδραση γλυκόλυσης

Πρόκειται για το κύριο ενδοκυτταρικό ανιόν το οποίο συναντάται σε οργανικές μορφές όπως τα φωσφολιπίδια, τα νουκλεοτίδια, οι φωσφοπρωτείνες, το ATP και σε ανόργανες που και κατεξοχήν προσδιορίζονται. Τα έμορφα συστατικά του αίματος περιέχουν μεγαλύτερες ποσότητες του εν λόγω ιχνοστοιχείου κυρίως ως φωσφορικούς εστέρες, η υδρόλυση των οποίων οδηγεί στην απελευθέρωση φωσφορυλικών ομάδων. Τέλος σε άμεση εξάρτηση με το μεταβολισμό των κυττάρων και δη της γλυκόλυσης όπου υπάρχουν αυξημένες απαιτήσεις για φωσφορυλιωμένα ενδιάμεσα προϊόντα, παρατηρούνται σημαντικές διακυμάνσεις ανάμεσα στα ενδο – και εξωκυτταρικά αποθέματα των μονο και διβασικών μορφών του ανόργανου φωσφόρου.

Δ. Μετατροπή της γλυκόζης σε γαλακτικό οξύ.

Μετατροπή της γλυκόζης σε γαλακτικό οξύ, μια διαδικασία γνωστή και ως γλυκόλυση, η οποία λαμβάνει χώρα εντός των ερυθρών αιμοσφαιρίων με ταχύτατους ρυθμούς. Σε θερμοκρασία περιβάλλοντος και ανάλογα με το ζωικό είδος, περίπου 10% της συνολικής ποσότητας καταναλώνεται ανά ώρα. Το παραπάνω ποσοστό αυξάνει αν το δείγμα έχει επιμολυνθεί με μικροοργανισμούς. Συστήνεται άμεση φυγοκέντριση ή προσθήκη φθοριούχου νατρίου, το οποίο δρα και ως αντισηπτικό. Με τον τρόπο αυτό και υπό ψύξη αποφεύγεται η απώλεια γλυκόζης για χρονικό διάστημα 48 ωρών.

ΕΙΣΟΔΟΣ ΧΗΜΙΚΩΝ ΟΥΣΙΩΝ ΣΤΟ ΠΛΑΣΜΑ ΑΠΟ ΤΟ ΕΣΩΤΕΡΙΚΟ ΤΩΝ ΕΡΥΘΡΩΝ ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΩΝ

Στην περίπτωση του καλίου και για εκείνα τα είδη ζώων στα οποία η ενδοκυτταρική του συγκέντρωση είναι κατά πολύ μεγαλύτερη αξίζει να σημειωθεί ότι η αντλία K-Na είναι περισσότερο ενεργή στους 4 βαθμούς από ότι στη θερμοκρασία περιβάλλοντος Τα ερυθρά αιμοσφαίρια του σκύλου διαθέτουν ένα μοναδικό σύστημα μεταφοράς ιόντων Νa εξωκυτταρικά – Ca ενδοκυτταρικά το οποίο φαίνεται να παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση του όγκου των ερυθρών. Γενικά ο όγκος των ερυθρών αιμοσφαιρίων επηρεάζει τη ροή των κατιόντων. Η μετακίνηση του νατρίου αυξάνεται όταν τα κύτταρα συρρικνώνονται ενώ του καλίου στην περίπτωση διόγκωσης αυτών.

Αναφορικά με τα ένζυμα και πέραν της επίδρασης της αιμόλυσης στις φασματοφωτομετρικές αναλύσεις, σημαντική είναι η είσοδος ορισμένων εξ αυτών στο πλάσμα. Ιδιαίτερα για την SGOT/AST και την LDH ψευδώς υψηλές συγκεντρώσεις παρατηρούνται και στις περιπτώσεις εκείνες όπου δεν διακρίνεται εμφανής λύση των ερυθρών αιμοσφαιρίων.

ΤΙ ΘΕΩΡΕΙΤΑΙ ΩΣ ΛΙΠΑΙΜΙΚΟ ΔΕΙΓΜΑ

Τα κυρία λιπίδια στο αίμα είναι τα τριγλυκερίδια, η χοληστερόλη, τα φωσφολιπίδια και μικρά ποσά ελεύθερων λιπαρών οξέων. Όπως είναι γνωστό υφίστανται στο πλάσμα σε σταθερή κολλοειδή μορφή ως μακρομοριακά συμπλέγματα με τις απολιπρωτεΐνες Οι λιποπρωτεΐνες ταξινομούνται σε τάξεις ανάλογα με την πυκνότητα τους με μεθόδους υπερφυγοκεντρίσεως. Πρόκειται για ουσίες με μικυλλιακή δομή στην οποία τα λιγότερο πολικά μόρια (τριγλυκερίδια και χοληστερόλη) καταλαμβάνουν το κέντρο ενώ τα περισσότερο πολικά (πρωτεΐνες και φωσφολιπίδια) βρίσκονται εκτεθειμένα στην υδατική επαφή. Η διάμετρος των λιποπρωτεινών καθώς και η συμμετοχή των λιπιδίων δη των τριγλυκεριδίων είναι αντιστρόφως ανάλογα με την πυκνότητά τους.

Ιδιαίτερα τα σωματίδια των χυλoμικρών και των VLDL απορροφούν σημαντικά το φως, προσδίδοντας στον ορό ή στο πλάσμα θολερότητα ή γαλακτώδη χροιά όταν βρίσκονται σε υψηλές συγκεντρώσεις (ΛΙΠΑΙΜΙΚΟ ΔΕΙΓΜΑ). Λόγω της πολύ χαμηλής πυκνότητας των χυλoμικρών εάν ένα τέτοιο δείγμα αφεθεί σε ηρεμία και υπό ψύξη για 6-12 ώρες θα σχηματιστεί γαλακτόχρoη στοιβάδα στην κορυφή. Στην περίπτωση που επικρατούν οι VLDL η παραπάνω στοιβάδα παρατηρείται στη βάση του δοκιμαστικού σωλήνα.

Κατά την ανάλυση ενός λιπαιμικού δείγματος και βάση των ιδιοτήτων των λιπιδίων που εν τροχάδην αναφέρθηκαν τρεις διαφορετικού τύποι σφαλμάτων δύναται να λάβουν χώρα:

ΗΛΕΚΤΡΟΛΥΤΙΚΟΣ ΑΠΟΚΛΕΙΣΜΟΣ

Στα εν λόγω δείγματα ένα σημαντικό τμήμα του συνολικού όγκου καταλαμβάνεται από την κεντρική περιοχή των λιπιδικών συμπλεγμάτων. Οι υδρόφοβες ομάδες που κυριαρχούν σε αυτή, ουσιαστικά απαγορεύουν την είσοδο ιόντων λόγω των υψηλών ενεργειακών αναγκών που απαιτούνται για την μετακίνηση ενός ιονικού διαλύτη από ένα αγώγιμο υδάτινο περιβάλλον με υψηλή διηλεκτρική σταθερά σε μια μη πολική λιπιδική φάση με χαμηλή διηλεκτρική σταθερά. Το σφάλμα που δημιουργείται από το περιγραφέν διφασικό σύστημα στη μέτρηση ηλεκτρολυτών είναι πάντα αρνητικό, δηλαδή η υπολογιζόμενη τιμή είναι μικρότερη από την πραγματική. Ο προσδιορισμός της θερμοδυναμικής δραστηριότητας όπως αυτή εξασφαλίζεται από όργανα άμεσης μέτρησης δυναμικού με τη χρήση ηλεκτροδίων συλλογής ιόντων, η απομάκρυνση των χυλομικρών με υπερφυγοκέντριση και ο υπολογισμός της % απόκλισης με διάφορες φόρμουλες που έχουν προταθεί, παρέχουν τη δυνατότητα παράκαμψης του σφάλματος.

ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΣ

Στην περίπτωση αυτή μικρές μη πολικές ουσίες με χαμηλή διαλυτότητα διανέμονται εντός της λιπιδικής φάσης. Συνεπώς μειώνεται η ενεργός συγκέντρωση των εν λόγω ουσιών, η οποία αντιδρά με τα προστιθέμενα στην υδάτινη φάση αντιδραστήρια της μεθόδου προσδιορισμού. Παραδείγματα αποτελούν οι στεροειδείς ορμόνες καθώς και διάφορες λιποφιλικές φαρμακευτικές ουσίες όπως η φαινοβαρβιτάλη και η διγοξίνη ενώ οι εργαστηριακές μέθοδοι που χρησιμοποιούνται ευρέως για τον υπολογισμό τους είναι οι χρωματογραφικές και οι ανοσοχρωματικές. Οι περισσότερες μελέτες που έχουν γίνει για την επιτυχή αντιμετώπιση των σφαλμάτων διαχωρισμού αφορούν την ανάπτυξη τεχνικών επιλεκτικής απομόνωσης των στεροειδών βάσει διαφορών στην διαλυτότητα τους.

ΔΙΑΧΥΣΗ ΦΩΤΕΙΝΗΣ ΑΚΤΙΝΟΒΟΛΙΑΣ

Το μέγεθος των κυκλοφορούντων λιποπρωτεινών κυμαίνεται από 100 εώς 1000 nm γεγονός το οποίο δύναται να οδηγήσει σε διάχυση του φωτός και παρεμβολή κατά τη διάρκεια φασμαφωτομετρικής ανάλυσης. Η παρεμβολή αφορά στη μείωση ποσού της ακτινοβολίας που μεταδίδεται σε ευθεία γραμμή από τη φωτεινή πηγή στον ανιχνευτή-φωτοκύτταρο και μεταφράζεται ως αύξηση της απορρόφησης του δείγματος. Μιας και οι περισσότερες βιοχημικές παράμετροι που προσδιορίζονται σε καθημερινή βάση εμπίπτουν σε αυτή την κατηγορία έχει αναπτυχθεί άφθονη βιβλιογραφία για την κατά το δυνατό εξάλειψη του σφάλματος. Προτείνονται ο διαχωρισμός των λιποπρωτεϊνών με τη χρήση ειδικών μεμβρανών, η αραίωση του δείγματος, η υπερφυγοκέντριση και τέλος η προσαρμογή κάθε φορά της καμπύλης απορρόφησης μιας ουσίας με βάση το δείγμα ως πρότυπο διάλυμα (serum blank).