ΔΕΙΓΜΑ ΚΑΙ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ

• Εν αρχή είναι η επιλογή του δείγματος.

• Καθοριστική για την αποτελεσματικότητα.

• Επόμενο βήμα ο τρόπος λήψης και η επιλογή του μέσου συντήρησής του.

• Επόμενο η επιλογή του εργαστηρίου:

• κόστος της εξέτασης
• ευκολία αποστολής
• εγγύτητα
• πιστοποιήσεις και διακριβώσεις
• εξειδικευμένο και έμπειρο προσωπικό
• ωράριο λειτουργίας

• Η επικοινωνία μεταξύ του κλινικού και του εργαστηριακού κτηνιάτρου.

• Η ακριβής διάγνωση από την ερμηνεία τόσο των κλινικών όσο και των εργαστηριακών ευρημάτων.

• Συμβουλή από το εργαστήριο πριν από τη λήψη του δείγματος.

• Κατάλληλο για το σκοπό για τον οποίο λήφθηκε:

• διάγνωση
• πιστοποίηση
• έρευνα
• διερεύνηση αποτελεσματικότητας εμβολίου ή θεραπείας

ΓΕΝΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ

• Από την πάσχουσα περιοχή όσο το δυνατόν γρηγορότερα μετά την έναρξη των συμπτωμάτων.

• Στα ιολογικά νοσήματα η έκκριση στο μέγιστο βαθμό στα πρώτα στάδια της μόλυνσης.

• Αυτό ισχύει και για τα παθογόνα βακτήρια του εντέρου.

• Από ζώα που νοσούν, αλλά και σε επαφή με αυτά, σε έξαρση.

• Στα ζώα σε επαφή πιθανώς σε αρχικά στάδια του νοσήματος, όπου εκκρίνουν τον γρήγορα πολλαπλασιαζόμενο παθογόνο παράγοντα.

• Δείγματα από τα όρια της αλλοίωσης μαζί με γειτονικό ιστό φαινομενικά υγιή.

• Στο κέντρο συνήθως νέκρωση του ιστού.

• Πολλαπλασιασμός των βακτηρίων στα όρια.

• Μεγαλύτερες δυνατές συνθήκες ασηψίας.

• Επιμόλυνση με βακτήρια της φυσιολογικής χλωρίδας.

• Με βακτήριο απαιτητικό στην ανάπτυξη υπάρχει κίνδυνος επιμολύνσεων.

• Το εργαστήριο πρέπει να ενημερωθεί για τυχόν θεραπείες.

• Λαμβάνονται κάποια πρόσθετα μέτρα ή να προτείνει εξ αρχής τη χρήση της PCR.

• Αν είναι δυνατόν το υλικό να είναι σε μεγάλη ποσότητα.

• Προστασία από ζωοανθρωπονόσους.

ΙΣΤΟΙ

• Υλικό μετά θάνατο πρέπει να λαμβάνεται όσο το δυνατόν γρηγορότερα.

• Παρόλα αυτά αν είναι το μόνο εργαλείο λαμβάνεται υλικό που δεν τηρεί αυτή την προϋπόθεση.

• Ένας μικροοργανισμός δεν χρειάζεται να είναι πλήρης και ζωντανός για να ταυτοποιηθεί → PCR.

• Ιστοί έξω από την θωρακική ή την κοιλιακή κοιλότητα συλλέγονται πριν από ιστούς που βρίσκονται μέσα σε αυτή.

• Συνθήκες στείρες και μέγεθος τουλάχιστον 1 cm³.

• Τοποθέτηση σε ξεχωριστό στείρο περιέκτη.

• Εάν το εργαστήριο βρίσκεται σε απόσταση καλό είναι να τοποθετείτε ο ιστός σε υλικό μεταφοράς για βακτηριολογικές.

• Τα δείγματα εντέρου όχι στον ίδιο περιέκτη με άλλους ιστούς.

• Σε περιπτώσεις αποβολών ολόκληρο το έμβρυο και ο πλακούντας.

• Αν όχι τότε τμήματα ιστών και έκκριμα από τη μήτρα.

• Αίμα από τη μητέρα για ορολογικές εξετάσεις.

ΥΓΡΑ

• Προτιμότερο υγρά σε σχέση με υλικό σε στυλεούς λόγω ποσότητας.

• Δυνατότητα φυγοκέντρισης.

• Καθαρίζουμε το σημείο της νύξης με ιωδιούχο ποβιδόνη ή άλλο απολυμαντικό σε επαφή με το δέρμα για ένα λεπτό.

• Αλκοολούχο διάλυμα 70% αναμονή να στεγνώσει.

ΣΤΕΙΛΕΟΙ

• Η πιο κοινή μέθοδος δειγματοληψίας.

• Πολλά βακτήρια δεν αντέχουν στην αφυδάτωση.

• Σε βαμβακοφόρο στυλεό χωρίς υγρασία είναι πιθανό να τα χάσουμε.

• Το είδος και το μήκος του στυλεού να είναι συμβατό με την περιοχή = αποφεύγονται οι επιμολύνσεις.

• Η καταλληλότερη μέθοδος σε περιπτώσεις:

• φλυκταινών στο δέρμα
• σε ωτίτιδες
• σε επιπεφυκίτιδες
• σε δείγματα από τη γεννητική οδό
• σε δείγματα από μαλακούς ιστούς
• σε βαθιά συρίγγια ή από πληγές

• Χρήσιμο να στέλνουμε δυο ή τρεις στυλεούς ανά εξέταση (αερόβια, αναερόβια ή καλλιέργεια μυκήτων).

ΑΙΜΑ

• Το αίμα να λαμβάνεται με άσηπτες συνθήκες.

• Δεν πρέπει να δημιουργηθούν πήγματα.

• Δυσκολία λόγω ασυνεχούς παρουσίας και μικρών αριθμών.

• Η βακτηριαιμία είναι διαλείπουσα (εξαίρεση η ενδοκαρδίτιδα και η αρτηρίτιδα)  λήψη δις/24ωρο.

• Ειδικά μπουκάλια, παραμονή σε δροσερό περιβάλλον:

• αερόβια βακτήρια
• αναερόβια
• χρήση αντιβιοτικών

• Επαρκής όγκος αίματος.

• Αναλογία όγκου αίματος / θρεπτικό ζωμό 5-10%.

ΚΟΠΡΑΝΑ

• Δείγμα είτε από πρόσφατη αφόδευση είτε λήψη από το ορθό.

• Καλύτερα μεγάλη ποσότητα παρά λήψη με στυλεό (π.χ Salmonella ή Campylobacter).

• Απαραίτητη η χρήση ειδικών υποστρωμάτων.

• Σε περίπτωση λήψης με στυλεό προσοχή να μην αφυδατωθεί.

• Προσθήκη Cary-Blair.

ΟΥΡΑ

• Φυσιολογικά στείρα μέχρι να φτάσουν στο μέσο της ουρήθρας.

• Η γεννητική οδός περιέχει πολλά βακτήρια.

• Ούρο λαμβανόμενο μετά από ούρηση ή και με καθετήρα μπορεί να είναι επιμολυσμένο.

• Ούρα που λαμβάνονται με κυστοκέντηση μπορεί να επιμολυνθούν με τα βακτήρια του δέρματος.

• Είναι σημαντικό να αναφέρεται πάντα η μέθοδος συλλογής τους.

• Η καλύτερη μέθοδος είναι με κυστοκέντηση, με καθετήρα ή με λήψη των ούρων στο μέσο της ροής τους.

• Αν έχει συντηρηθεί σε περιέκτη με βορικό οξύ δεν είναι κατάλληλο για άλλες εξετάσεις.

ΠΡΟΣΤΑΤΙΚΟ ΥΓΡΟ

• Για καλλιέργεια είναι προτιμότερο να λαμβάνεται η τρίτη φάση του εκσπερματίσματος.

ΚΟΛΠΙΚΑ ΔΕΙΓΜΑΤΑ

• Δεν συστήνεται ως εξέταση ρουτίνας λόγω φυσιολογικής χλωρίδας.

ΑΠΟΣΤΗΜΑΤΑ

• Αν είναι δυνατόν περίπου 3 ml πύου και ξέσματα του εσωτερικού τοιχώματος του αποστήματος.

• Συχνά το πύο από το κέντρο του αποστήματος είναι στείρο.

• Πύο από πρόσφατα δημιουργημένο απόστημα έχει τα καλύτερα αποτελέσματα.

• Συχνή η παρουσία αναερόβιων βακτηρίων.

ΟΦΘΑΛΜΟΣ

• Δείγμα επιπεφυκότα με στυλεό, κρατάμε τα βλέφαρα ανοικτά με ήπιες κινήσεις.

ΔΕΡΜΑ

• Αν υπάρχουν φλύκταινες και κύστεις, καθαρίζεται η επιφάνεια με 70% αιθυλική αλκοόλη, στέγνωμα και λήψη με καθαρή βελόνα.

• Από τα έλκη υλικό με στυλεό (καλύτερα όχι από το κέντρο).

ΓΑΛΑ

• Σύντομα μετά την παρουσία μαστίτιδας.

• Προσοχή για χορήγηση ενδομαστικών ή συστηματικών αντιβιοτικών.

• Πλύσιμο και σκούπισμα επιμελώς με τη χρήση πετσέτας ή γαζών.

• Καλύτερη η χρήση 70% αλκοόλης σε βαμβάκι και εκτενές τρίψιμο των θηλών.

• Η πρώτη ριπή του γάλακτος απορρίπτεται.

• Άμεσα σε πάγο το δείγμα.

ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑ

• Διατήρηση σε πάγο ή στο ψυγείο και αποστολή μέσα στο επόμενο 24ωρο.

• Οι ιστοί και τα υγρά μπορούν να καταψυχθούν, αλλά δεν είναι η συνιστώμενη μέθοδος διατήρησης.

• Εξαίρεση η ανάλυση για τοξίνες όπως του Clostridium perfringens και του Cl. botulinum.

• Απαραίτητη πάντα η αποστολή των δειγμάτων με ανάλογες παγοκύστεις.

ΑΝΑΕΡΟΒΙΑ ΒΑΚΤΗΡΙΑ

• Πολύ σημαντική η λήψη του υλικού.

• Δεν αντέχουν σε επαφή με το οξυγόνο πάνω από 20 λεπτά.

• Να μην επιμολυνθεί με τη φυσιολογική αναερόβια χλωρίδα γειτονικών βλεννογόνων.

• Γρήγορη μεταφορά στο εργαστήριο.

• Πιο εύκολη η απομόνωση από κομμάτια ιστών (4cm3) ή από αρκετά ml υγρού σε στείρο περιέκτη.

• Τα υλικά σε στυλεούς πρέπει υποχρεωτικά να τοποθετηθούν σε υπόστρωμα μεταφοράς (Amies Gel ή αναερόβιο φιαλίδιο).

• Σε περίπτωση που υπάρχει υποψία για εντεροτοξιναιμία χρειάζονται τουλάχιστον 20ml περιεχόμενο από τον ειλεό.

ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ

• Μικρά προκαρυωτικά κύτταρα με διαφορετικές απαιτήσεις το ένα από το άλλο.

• Απαιτούν διαφορετικά θρεπτικά υποστρώματα.

• Κάποια είναι πολύ απαιτητικά και χρειάζονται ειδικά εκλεκτικά υποστρώματα για την ανάπτυξη τους.

• Απαιτούν την ύπαρξη διαφορετικών ποσοστών οξυγόνου ή διοξειδίου του άνθρακα.

• Χρειάζονται διαφορετικό χρόνο ανάπτυξης.

• Επίσης έχουν διαφορετικές απαιτήσεις σε σχέση με τη θερμοκρασία (20-40 °C) Παράδειγμα η Salmonela.

• Η διαφοροποίησή και ταυτοποίησή τους στηρίζεται στο μέγεθος, στη μορφολογία (κόκκοι, βάκιλοι, σπείρες και δονάκια), στη διάταξη (μονά, ζεύγη, αλυσίδες) και στις βιοχημικές αντιδράσεις τους.

• Το πρώτο βήμα είναι η οπτική αξιολόγηση του τρυβλίου.

• Τα περισσότερα βακτήρια δημιουργούν ορατές αποικίες σε 24 ώρες. Κάποια απαιτούν 48-72 ή και περισσότερες ώρες.

• Παρατηρούμε:

• τη μορφολογία της αποικίας
• την παρουσία αιμόλυσης σε αιματούχο άγαρ
• πολλές φορές η μυρωδιά είναι χαρακτηριστική

• Η ανάπτυξη τους σε διαφορετικά υποστρώματα.

• Η ύπαρξη διαφορετικών ειδών αποικιών.

• Στη συνέχεια σημαντικό και μη εξαιρετέο βήμα η χρώση κατά Gram.

• Και άλλες, Giemsa (δείγματα που περιέχουν κύτταρα), Ziehl-Nielsen (μυκοβακτηρίδια).

• Τα παραπάνω στοιχεία μας οδηγούν σε μια πιθανή ταυτοποίηση.

• Περισσότερα είδη αποικιών ή οι αποικίες δεν είναι καθαρές (π.χ. Proteus) πρέπει να γίνει ανακαλλιέργεια.

• Αυτό απαιτεί περισσότερο χρόνο!

• Δεν νοείται βιοχημικός χαρακτηρισμός και ταυτοποίηση, αλλά και αντιβιόγραμμα χωρίς καθαρές και αρκετές αποικίες.

• Για να γίνει αυτό μία αποικία ανακαλλιεργείται σε καθαρό υπόστρωμα.

ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ

• Αυτόματα ή μη συστήματα.

• Στηρίζονται στις βιοχημικές αντιδράσεις των βακτηρίων.

• Επώαση στους 37°C για 24-48 ώρες (και άλλος χρόνος!).

• Διαφορετικά είδη των τεστ ταυτοποίησης = διαφορετικός αριθμός βιοχημικών αντιδράσεων.

• Σε όλα αξιολόγηση των αλλαγών στο χρώμα μιας αντίδρασης.

• Στα αυτόματα η αξιολόγηση είναι αντικειμενική με τη χρήση φασματοφωτομέτρων.

ΑΝΑΓΝΩΣΗ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ

• Η απομόνωση ενός βακτηρίου δεν αποτελεί πάντα διάγνωση του περιστατικού.

• Το βακτήριο μπορεί να μολύνει δευτερογενώς.

• Τα εντεροβακτηριοειδή είναι πανταχού παρόντα (επιμόλυνση ή μεταθανάτιο εξάπλωση).

• Ένα αρνητικό αποτέλεσμα δεν σημαίνει ότι δεν ευθύνεται βακτήριο.

• Πολλοί λόγοι για την αποτυχία απομόνωσης (επιμολύνσεις, κακός χειρισμός, δεν εκκρίνεται πλέον).

• Αρνητικά αποτελέσματα που δεν εξηγούνται από το περιστατικό, περαιτέρω διερεύνηση των περιστατικών και με άλλα μέσα.

• Κάθε μέθοδος έχει διαφορετική ευαισθησία.

• Δείγμα είναι αρνητικό στην καλλιέργεια ή στην ELISA μπορεί να είναι θετικό στην PCR.

• Οι εργαστηριακές εξετάσεις μπορεί να είναι και ακριβές και χρονοβόρες.

• Για αυτό είναι προς όφελος όλων να μην υπάρχουν απώλειες ‘ενέργειας’ σε πληροφορίες που μπορεί να μας απομακρύνουν από τη σωστή διάγνωση.

• Η επωφελής επικοινωνία μεταξύ εργαστηριακού και κλινικού βαρύνει ισομερώς και τους δύο.