Ο ΧΡΥΣΟΣ ΚΑΝΟΝΑΣ ΣΤΙΣ ΜΟΡΙΑΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΥΣ

Τα τελευταία χρόνια η ανάπτυξη της PCR έχει βελτιώσει κατά πολύ την άμεση διάγνωση των λοιμωδών νοσημάτων. Πάραυτα, παραμένει ακόμα αρκετά χρονοβόρα και επιρρεπής σε ψευδώς θετικά και ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα. Επίσης, εφόσον η PCR (συμβατική) είναι μία μη ποσοτική μέθοδος, ο ακριβής αριθμός των αντιγράφων των παθογόνων παραγόντων στα δείγματα δε μπορεί να καθοριστεί.

Η παράμετρος όμως αυτή είναι μείζονος σημασίας για τον έλεγχο κάθε νόσου και μέχρι τώρα επιτυγχανόταν με περίπλοκες διαδικασίες. Το γεγονός αυτό κατέδειξε την αναγκαιότητα της ανάπτυξης μιας γρήγορης και πλέον ευαίσθητης μοριακής μεθόδου η οποία θα μπορεί να ποσοτικοποιεί τους παθογόνους παράγοντες σε διάφορους ιστούς των ζώων.

Έτσι αναπτύχθηκε η real-time PCR, η οποία είναι η πιο ευαίσθητη μοριακή μέθοδος στον τομέα της μοριακής βιολογίας. Η real-time PCR (σε πραγματικό χρόνο PCR) έδωσε μεγάλη ώθηση στην εξέλιξη και άνοδο των υπαρχουσών μεθοδολογιών λόγω της ποσοτικοποίησης του παθογόνου παράγοντα. Είναι μια μέθοδος ευρέως χρησιμοποιούμενη στην Ιατρική και θεωρείται ως η πιο ευαίσθητη μέθοδος ενίσχυσης τμημάτων DNA και RNA. Η μέθοδος στηρίζεται στη μέτρηση μιας φθορίζουσας ουσίας που προσκολλάται στη διπλή αλυσίδα του DNA.

Αν θέλαμε να συγκρίνουμε τις δύο αυτές μεθοδολογίες θα πρέπει να σταθούμε στα παρακάτω σημαντικά για την αξιοπιστία των αποτελεσμάτων στοιχεία:

1. Η ευαισθησία της real time PCR ως προς την ικανότητα ανίχνευσης των παραγόντων, έχει συγκριθεί σε πολλές μελέτες με εκείνη της συμβατικής-ποιοτικής PCR. Στις περισσότερες μελέτες, περιγράφεται ότι η ευαισθησία της real-time PCR είναι περίπου 10 φορές μεγαλύτερη από αυτή της συμβατικής PCR μειώνοντας έτσι τα ψευδώς αρνητικά δείγματα αφού μπορεί να ανιχνεύσει το ζητούμενο παθογόνο παράγοντα, ακόμη και όταν η συγκέντρωση αυτού στο δείγμα είναι πολύ μικρή.

2. Τα αποτελέσματα της μεθόδου δίνονται αυτόματα σε ένα υπολογιστή, ο οποίος είναι συνδεδεμένος με το μηχάνημα και μάλιστα μπορούμε να παρακολουθούμε την εξέλιξη της ενίσχυσης του DNA από το πρώτο κιόλας στάδιο της μεθόδου.

3. Επιπλέον, για την ανάγνωση των αποτελεσμάτων της συμβατικής PCR πρέπει να ακολουθήσει η χρώση του προϊόντος της μεθόδου με βρωμιούχο αιθίδιο και η ηλεκτροφόρηση του προϊόντος για να διαπιστωθεί το μέγεθος του (βλέπε Εικόνα). Τα στάδια αυτά εκτελούνται από το τεχνικό προσωπικό του εργαστηρίου και αποτελούν το κρίσιμο σημείο κατά το οποίο συμβαίνουν επιμολύνσεις του προϊόντος και των αντιδραστηρίων, με αποτέλεσμα να προκύπτουν ψευδώς θετικά αποτελέσματα και λάθη κατά την ανάγνωση και την καταγραφή αυτών. Με τη real-time PCR όλα αυτά εκμηδενίζονται γιατί όπως προαναφέρθηκε η ανάγνωση και η καταγραφή των αποτελεσμάτων γίνεται αυτόματα από το λογισμικό του υπολογιστή και τα προϊόντα της ενίσχυσης δεν έρχονται σε επαφή με το εργαστηριακό περιβάλλον.

4. Τέλος έχει υπολογιστεί ότι η ικανότητα πρόσδεσης του βρωμιούχου αιθιδίου με το προϊόν της ενίσχυσης είναι πολύ μικρότερη σε σχέση με αυτή των χρωστικών της real-time PCR.

Από τα παραπάνω είναι φανερό ότι, λόγω της μεγάλης ευαισθησίας της, η real-time PCR είναι ικανή:

• να εντοπίσει υποκλινικές μολύνσεις

• να χρησιμοποιηθεί για την πρόβλεψη του χρόνου εξέλιξης μιας νόσου σε οξείες καταστάσεις

• να χρησιμοποιηθεί για τον έλεγχο της αποτελεσματικότητας θεραπειών

Από τα παραπάνω προκύπτει ότι η real-time PCR υπερέχει της συμβατικής PCR γι’ αυτό και τείνει να αντικαταστήσει πλήρως τη χρήση της συμβατικής PCR.

Στα παρακάτω γραφήματα δίνονται αποτέλεσμα των δύο μεθοδολογιών (real-time PCR και συμβατικής PCR) με σκοπό να δοθεί ένα παράδειγμα για τον τρόπο με τον οποίο ερμηνεύονται (“διαβάζονται”) τα αποτελέσματα σε κάθε μία από τις μεθόδους αυτές.

Είναι εμφανής η διαφορά στην τεχνολογία που χρησιμοποιείται καθώς και στην ακρίβεια των αποτελεσμάτων μεταξύ των δύο μεθόδων,