Ανάγκη μελέτης-ανίχνευσης DNA με πολύ μικρή μάζα (1 γονίδιο=2pg, σε δείγμα 106 κυττάρων)
Ανακάλυψη PCR ως μέθοδος πολλαπλασιασμού τμήματων DNA
PCR (Polymerase chain reaction)/Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης
- Μοριακή μέθοδος πολλαπλασιασμού μιας αλληλουχίας-στόχου DNA
- In vitro μέθοδος (χωρίς τη χρήση ζωντανών μικροοργανισμών πχ. βακτήρια)
- Σύνθεση DNA ολιγονουκλεοτιδίων (εκκινητές για την ένερξη της αντιγραφής-primers)
- Taq DNA πολυμεράση (ένζυμο επιμήκυνσης εκκινητών)
Ένας πλήρης κύκλος μιας αντίδρασης αλυσιφωτής αντίδρασης πολυμεράσης περιλαμβάνει τρία στάδια:
- Αποδιάταξη του DNA (denaturation)
- Πρόσδεση των εκκινητών στο DNA εκμαγείο (annealing)
- Επιμήκυνση των εκκινητών (extension)
Real-time PCR (qPCR)
- Ποσοτική μέθοδος
- Σε πραγματικό χρόνο
- Υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα
- Φθορίζοντα μόρια που δεσμεύονται στην αλληλουχία-στόχο
- Ct(Threshold cycle) = κύκλος ανίχνευσης φθορισμού
Η τιμή του Ct είναι αντιςτρόφως ανάλογη της ποσότητας DNA άρα και του βακτηριακού, παρασιτικού ή ιικού φορτίου.
Όσο μικρότερο το Ct τόσο μεγαλύτερο το φορτίο.
PT-PCR(Reverse transcription-PCR)
- RNA ως αρχικό δείγμα
- Ιοί στη διάγνωση
- Γονιδιακή έκφραση
- Μετατροπή RNA σε DNA με αντίστροφη μεταγραφή
Conventional PCR (Συμβατική)
- Ποιοτική μέθοδος (υπάρχει ή όχι η αλληλουχία που μας ενδιαφέρει)
- Χρήση για sequenceing, cloning και άλλες τεχνικές μοριακής βιολογίας
Multiplex Real-time PCR
- Ταυτόχρονη ανίχνευση 2 ή περισσότερων γονιδίων-στόχων στην ίδια αντίδραση πχ 2 ή 3 παθογόνα
