ΣΤΟΧΟΙ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗΣ ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗΣ

• Αιτιολογική διάγνωση.

• Ασυμπτωματικοί φορείς.

• Αποφυγή μετάδοσης μέσω μετάγγισης αίματος.

• Έλεγχος για τη μετοίκηση ζώων σε μη ενδημικές περιοχές.

• Θεραπευτική ανταπόκριση.

Τα πρoηγούμενα χρόνια, η διάγνωση στηριζόταν κατά το πλείστον σε ορολογικές δοκιμές και επιχρίσματα από τους λεμφαδένες και το μυελό των οστών. Όμως από τη δεκαετία του 1990 η χρήση και άλλων διαγνωστικών εργαλείων, όπως η PCR, αύξησε σημαντικά την ικανότητα των ερευνητών στη μελέτη της Λεϊσμανιώσεως τόσο στον άνθρωπο όσο και στο σκύλο. Ακόμα περισσότερο, την τελευταία δεκαετία η εφαρμογή καινοτόμων βιομοριακών τεχνικών έδωσε εντυπωσιακή ώθηση στην ανάπτυξη νέων εργαστηριακών προσεγγίσεων και μεθοδολογιών. Το γεγονός αυτό βελτίωσε τη δυνατότητα διάγνωσης της Λεϊσμανιώσεως στο σκύλο και πρόσθεσε σημαντικά στοιχεία στην επιδημιολογία της νόσου. Σταδιακά επίσης η real-time PCR αντικατέστησε τη συμβατική (ποιοτική) και τη nested PCR ως πλέον ευαίσθητη και ασφαλής μέθοδος.

Δύο είναι τα κύρια επιδημιολογικά δεδομένα που οι μοριακές αυτές τεχνικές επιβεβαίωσαν.

1. Η μόλυνση στις ενδημικές περιοχές είναι εκτεταμένη αλλά όλα τα μολυσμένα ζώα δεν εμφανίζουν κλινική νόσο. Ως γνωστόν δύο είναι τα πρότυπα εξέλιξης, τα οποία και έχουν θεμελιωθεί. Υπάρχουν ζώα με κλινικά σημεία ποικίλης βαρύτητας σε σύντομο χρονικό διάστημα. Πιστεύεται ότι τα ζώα αυτά δεν έχουν αναπτύξει αποτελεσματική κυτταρική ανοσία εάν και έχουν δυνατή αλλά ανεπαρκή χυμική ανοσία. Ο δεύτερος πληθυσμός παραμένει ασυμπτωματικός για χρονικό διάστημα ετών ή καθόλη τη διάρκεια ζωής. Ωστόσο μεταβολή στην κατάσταση υγείας του ζώου, η χορήγηση ανοσοκατασταλτικών φαρμάκων ή κάποιο ανοσοκατασταλτικό νόσημα δυνατόν να οδηγήσει σε ενεργοποίηση της λανθάνουσας λοίμωξης και συνεπώς στην ανάπτυξη κλινικών σημείων.

2. Η μόλυνση επεκτείνεται ταχύτατα στον πληθυσμό των σκύλων ειδικά όταν οι περιβαλλοντικές συνθήκες είναι ιδανικές.

Σε μία ενδιαφέρουσα έρευνα που διενεργήθηκε σε αγροτική περιοχή της Νάπολης στην Ιταλία όπου εισήχθη ομάδα 43 αρνητικών στη Leishmania σκύλων Beagle μετά από διάστημα 3 ετών βρέθηκαν 97,3% των ζώων θετικά σε qPCR (μυελός των οστών) και 75,7% εξ αυτών οροθετικά στον Ανοσοφθορισμό (IFAT). Το ενδιαφέρον από κλινική άποψη είναι ότι τα 19 από αυτά ανέπτυξαν κλινικά συμπτώματα και σε χρονικό διάστημα 3 έως 14 μηνών αφότου όλες οι εργαστηριακές μέθοδοι ήταν θετικές. Η πλέον αξιόπιστη διαγνωστική προσέγγιση είναι η ανεύρεση DNA του λοιμογόνου παράγοντα στο αίμα και τους διάφορους ιστούς και η ανίχνευση ειδικών αντισωμάτων στον ορó. Επιπροσθέτως η real-timeq PCR (qPCR) είναι μια ποσοτική μέθοδος που ταυτοποιεί και τιτλοποιεί ένα παθογόνο παράγοντα στους ιστούς των ζώων.

Όπως φαίνεται στο παραπάνω σχήμα οι εργαστηριακές μέθοδοι είναι πολλές και η καθεμιά έχει τα πλεονεκτήματα, τα μειονεκτήματα και τη δική της προτεινόμενη χρήση.

Χαρακτηριστικά αναφέρεται ότι η απομόνωση και καλλιέργεια του εν λόγω λοιμογόνου παράγοντα από μολυσμένους ιστούς είναι ιδιαίτερα χρονοβόρα και εμφανίζει χαμηλότερη ευαισθησία από τη real-time PCR και τις ορολογικές δοκιμές. Η μικροσκοπική παρατήρηση σε κεχρωσμένα επιχρίσματα από ιστούς όπως το δέρμα, ο σπλήνας, ο μυελός των οστών και οι λεμφαδένες είναι καθοριστικές και ειδικότερα οι λεμφαδένες και ο μυελός των οστών είναι ειδική και ευαίσθητη τεχνική για την επιβεβαίωση της νόσου αλλά η ευαισθησία της κυμαίνεται σε ποσοστά < 30% στα ασυμπτωματικά ζώα.

Με την εισαγωγή της real-time PCR ως διαγνωστικού εργαλείου μία μεγάλη πρόκληση για τους ερευνητές ήταν η χρήση της για τον καλύτερο χαρακτηρισμό και κατανόηση της σχέσης μεταξύ παρασίτου/ξενιστή γεγονός που θα αξιοποιούσε τη μέθοδο και ως προς την προγνωστική της αξία.

Σε έρευνα που διεξήγαγε το Πανεπιστήμιο της Βαρκελώνης με συγχρηματοδότηση της Ευρωπαϊκής Ένωσης για νοσήματα, τα οποία ενδιαφέρουν τη δημόσια υγεία, έγινε παρακολούθηση 710 δεσποζώμενων σκύλων ενδημικής της Λεϊσμανίασης περιοχής. Η μελέτη διήρκησε 3 έτη. Τα αποτελέσματα συνοψίζονται στους παρακάτω πίνακες.

Ως γνωστό λόγω του ποικίλου τροπισμού που δεικνύει το παράσιτο όσον αφορά στους διάφορους ιστούς, είναι σημαντικό για τον κλινικό κτηνίατρο να επιλέξει τον πλέον κατάλληλο από αυτούς ώστε να εξάγει ασφαλή συμπεράσματα μιας και η συγκεκριμένη μέθοδος εκτελείται σε πληθώρα βιολογικών υλικών, όπως φαίνεται και στο παραπάνω σχήμα.

Καταλήγοντας στις ενδημικές περιοχές μεγάλο μέρος των σκύλων έχουν εκτεθεί στο παράσιτο (θετικές ορολογικές δοκιμές) σε σχέση με ένα μικρότερο ποσοστό που τελικώς θα νοσήσει. Ο τίτλος των ορολογικών δοκιμών παραμένει υψηλός για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα πριν τα επίπεδα των αντισωμάτων μειωθούν. Από την άλλη, οι σκύλοι παραμένουν οροαρνητικοί για ποικίλο χρονικό διάστημα μετά τη μόλυνση. Μελέτες δείχνουν ότι η οροθετικότητα εμφανίζεται εντός 1 έως 22 μηνών από τη φυσική μόλυνση ενώ σε πειραματικό ενοφθαλμισμό εντός 1 έως 6 μηνών. Η ανίχνευση και η ασφαλής ποσοτικοποίηση του παρασιτικού φορτίου που πετυχαίνεται με τη real-timePCR είναι πολύτιμος βοηθός στη διάγνωση κυρίως στις περιπτώσεις με χαμηλό τίτλο αντισωμάτων ή όταν δεν έχει υπάρξει ακόμα χυμική ανοσία ή έχει κατασταλεί η κυτταρική ανοσία. Επίσης, αναφορικά με την προγνωστική αξία της real-time PCR. φαίνεται ότι σκύλοι των οποίων το παρασιτικό φορτίο στο αίμα κατατάσσεται ως μέσο, ψηλό ή πολύ υψηλό νοσούν ή τελικά θα νοσήσουν. Η μέθοδος λοιπόν έχει υψηλή προγνωστική αξία γεγονός που καταδεικνύεται και από τη χρησιμοποίησή της για το σχεδιασμό νέων φαρμάκων και εμβολίων για την καταπολέμηση της νόσου. Σε ζώα που ακολουθούν κάποιο από τα προτεινόμενα θεραπευτικά σχήματα συστήνεται ο έλεγχος του παρασιτικού φορτίου ένα μήνα μετά το τέλος αυτού. Ειδικότερα φαίνεται ότι η real-time PCR είναι ένα αποτελεσματικό εργαλείο για τον έλεγχο της θεραπευτικής ανταπόκρισης ιδιαίτερα σε περιστατικά όπου χρειάζονται επανάληψη της θεραπείας και επιπροσθέτως για την πρώιμη ανίχνευση πιθανών υποτροπών ώστε να αποφευχθεί η εκδήλωση νόσου.