Μοριακές Τεχνικές και Μέθοδοι στο οπλοστάσιο της Μοριακής Βιολογίας και της Έρευνας για πάνω από τρεις δεκαετίες.

Απαρχαιωμένες και ξεπερασμένες ή εξελισσόμενες και πάντα επίκαιρες?

Εφαρμογές όχι μόνο στην έρευνα, αλλά και στη διάγνωση.

Προσδιορισμός αλληλουχίας (Sequencing)

Η αλληλούχιση είναι η διαδικασία που προσδιορίζει την αλληλουχία των νουκλεοτιδίων στο DNA και συμπεριλαμβάνει όλες τις μεθόδους και τεχνολογίες που έχουν χρησιμοποιηθεί για τον καθορισμό της σειράς των 4 βάσεων, αδενίνη, γουανίνη, κυτοσίνη και θυμίνη. Η έλευση γρήγορων μεθόδων έχει επιταχύνει την ιατρική και βιολογική έρευνα.

Εικόνα 1. Η ιστορία της αλληλούχισης από το 1977 έως σήμερα. (Πηγή: Wikipedia)

Από το 1977 που πρωτοανακαλύφθηκε η μέθοδος τερματισμού αλυσίδας (Μέθοδος Sanger) με τη χρήση δι-δεοξυνουκλεοτιδίων, έως σήμερα με την Αλληλούχιση με Σύνθεση (Sequencing by Synthesis, Illumina) και άλλες τεχνολογίες,η αλληλούχιση έχει άπειρες εφαρμογές στην έρευνα, όπως στην Μοριακή Βιολογία, την Εξελικτική Βιολογία, την Ιατρική, την Ιολογία και τη Μεταγονιδιοματική, αλλά και στη διάγνωση (π.χ. καρκίνος).

Εικόνα 2. Αλληλούχιση με τη μέθοδο Sanger μεχρήση ραδιενεργών νουκλεοτιδίων, ανάλυση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου και αυτοραδιογραφία (αριστερά). Αλληλούχιση με τη μέθοδο Sanger με τη χρήση νουνλεοτιδίων συζευγμένων με φθοροχρώματα, ανάλυση με ηλεκτροφόρηση σε τριχοειδή και αυτόματη ανάλυση (κέντρο). Αλληλούχιση με σύνθεση (δεξιά).

Ανάλυση Γενοτύπου (Genotyping)

Ο γενότυπος ενός ατόμου ή οργανισμού, εκτός από όλο το γονιδίωμα και το σύνολο των γονιδίων του, μπορεί να αναφέρεται σε συγκεκριμένα αλληλόμορφα ή συγκεκριμένες ομάδες γονιδίων ή πολυμορφισμών που προσδίδουν συγκεκριμένες ιδιότητες ή φαινοτύπους. Για την ανάλυση του γενοτύπου χρησιμοποιούνται Μοριακές Τεχνικές όπως ανάλυση RFLPs, PCR, Αλληλούχιση, Μικροσυστοίχιες DNA κ.α., ενώ βρίσκει εφαρμογές σε όλους τους οργανισμούς και τον άνθρωπο

Ανάλυση Πολυμορφισμών Μεγέθους ΘραύσματοςΠεριορισμού (RFLPs)

Η ανάλυση πολυμορφισμών μεγέθους θραύσματος περιορισμού είναι μία τεχνική η οποία εκμεταλλεύεται τους πολυμορφισμούς ως γενετικούς δείκτες, ώστε να διαχωρίσει άτομα, πληθυσμούς ή είδη, ή για να προσδιορίσει τις ακριβείς θέσεις γονιδίων σε ένα καθορισμένο τμήμα DNA. Οι πολυμορφισμοί αυτοί είναι διαφορές σε ομόλογες αλληλουχίες DNA, οι οποίες μπορούν να ανιχνευθούν από την παρουσία θραυσμάτων διαφορετικού μεγέθους, έπειτα από κατάτμηση των υπό εξέταση δειγμάτων (ολικό DNA ή προϊόντα PCR) με συγκεκριμένες ενδονουκλεάσες περιορισμού. Οι περισσότεροι από αυτούς τους πολυμορφισμούς ως γενετικοί δείκτες είναι συνεπικρατείς  (μπορούν αν ανιχνευθούν και τα δύο αλληλόμορφα σε ένα ετερόζυγο δείγμα) και δύναται να συνδέονται ειδικά με συγκεκριμένους γενετικούς τόπους.

Εικόνα 3. Ανάλυση Πολυμορφισμού Θραύσματος Περιορισμού (πηγή NCBI). Μία μεταλλαγή εξαλείφει μία θέση περιορισμού σε μία αλληλουχίαDNA (αριστερά). Το DNA κατατέμνεται με μία ενδονουκλεάση περιορισμού, τα θραύσματα που προκύπτουν διαχωρίζονται ηλεκτροφορητικά σε πήκτωμα αγαρόζης, μεταφέρονται κατά Southern, ενώ ακολουθεί υβριδισμός με ραδιενεργό ιχνηθέτη και αυτοραδιογραφία (δεξιά).

Η ανάλυση RFLP βρίσκει πολλές εφαρμογές, όπως στη γονιδιακή χαρτογράφηση, την ανάλυση γενετικών διαταραχών, το διαχωρισμό οργανισμών, στον καθορισμό πατρότητας, το χαρακτηρισμό της γενετικής ποικιλομορφίας, καθώς και στο χαρακτηρισμό προτύπων αναπαραγωγής σε ζωικούς πληθυσμούς.

Μερικά παραδείγματα της χρήσης της ανάλυσης RFLP σε κτηνιατρικές εφαρμογές:

Nuchprayoon, S., Junpee, A., Nithiuthai, S., Chungpivat, S., Suvannadabba, S. and Poovorawan, Y. (2006). Detection of filarial parasites in domestic cats by PCR-RFLP of ITS1. Veterinary Parasitology140, 366–372.

Acardi, S. A., Liotta, D. J., Santini, M. S., Romagosa, C. M. and Salomón, O. D. (2010). Detection of Leishmania infantum in naturally infected Lutzomyia longipalpis (Diptera: Psychodidae: Phlebotominae) and Canis familiaris in Misiones, Argentina: the first report of a PCR-RFLP and sequencing-based confirmation assay. Mem. Inst. Oswaldo Cruz105, 796–799.

Lyu, S., Yang, P., Liu, Y., Song, T., Zhang, Z., Shi, Q., Chen, F., Liu, X., Li, Z., Ru, B., et al. (2021). Genetic effects of MOGAT1 gene SNP in growth traits of Chinese cattle. Gene769, 145201.